Un bonmicroscopihauria de tenir tres característiques:
Bona resolució: la capacitat de resolució es refereix a la capacitat de produir imatges separades d'objectes molt propers perquè es puguin distingir com a dues entitats separades. Resolució:
Aproximadament 0,2 mm (200μm) a ull nu
El microscopi òptic és d'aproximadament 0,2μm
La microscòpia electrònica és d'aproximadament 0,5 nm
. La resolució depèn de l'índex de refracció. L'oli té un índex de refracció més alt que l'aire.
Bon contrast: es pot millorar encara més tenyint la mostra.
Bona ampliació: S'aconsegueix utilitzant lents còncaves.
Microscòpia de camp clar o llum
La microscòpia de camp clar o de llum produeix imatges fosques sobre un fons més clar.
microscòpia de camp fosc
Principi: a la microscòpia de camp fosc, els objectes semblen brillants sobre un fons fosc. Això es pot aconseguir mitjançant l'ús de condensadors especials de camp fosc.
Aplicacions: S'utilitza per identificar cèl·lules viables, sense taques i bacteris prims com els espiroquets que no es poden observar amb microscòpia de llum.
microscopi de contrast de fases
Visualitza les cèl·lules vives creant diferències de contrast entre les cèl·lules i l'aigua. Converteix diferències subtils en l'índex de refracció i la densitat cel·lular en canvis fàcilment detectables en la intensitat de la llum.
Útil per estudiar:
moviment microbià
Determinar la forma de les cèl·lules vives
Detectar components bacterians com endospores i cossos d'inclusió.
Microscopi de fluorescència
Com funciona: quan els colorants fluorescents s'exposen a la llum ultraviolada (UV), s'exciten i fan fluorescència, és a dir, converteixen aquest raig invisible de longitud d'ona curta en llum de longitud d'ona més llarga (llum visible).
Aplicacions: la microscòpia d'epifluorescència té les aplicacions següents:
Autofluoresceix quan es col·loca sota llum UV, com la ciclosporina
Microorganismes recoberts de colorants fluorescents, com ara taronja atriol per als paràsits de la malària (QBC) i aurinol per Mycobacterium tuberculosis.
Immunofluorescència: utilitza anticossos marcats amb colorants fluorescents per detectar antígens de superfície cel·lular o anticossos que s'uneixen als antígens de superfície cel·lular. Hi ha tres tipus: FI directe, FI indirecta i citometria de flux.
microscopi electrònic
Va ser inventat per Ernst Ruska l'any 1931. Es diferencia de la microscòpia de llum d'una manera diferent.
Hi ha dos tipus d'EM:
Transmissió EM (tipus MC, examina l'estructura interna, resolució 0,5 nm, dóna una visió bidimensional)
Escaneig EM (examina la superfície amb una resolució de 7 nm, proporcionant una vista 3D)
Principis de la microscòpia electrònica de transmissió
Preparació de la mostra: realitzeu els passos següents a les cèl·lules per preparar mostres molt primes (de 20 a 100 nm de gruix)
Fixació: Fixeu les cèl·lules amb glutaraldehid o tetròxid per estabilitzar-les.
Deshidratació: després es deshidrata la mostra utilitzant un dissolvent orgànic com l'acetona o l'etanol.
Incrustació: la mostra està incrustada en un polímer plàstic, que després s'endureix per formar una massa sòlida. La majoria dels polímers plàstics són insolubles en aigua. Per tant, les mostres s'han de deshidratar completament abans d'incorporar-les.
Secció: A continuació, es talla l'exemplar en seccions fines amb un ultramicròtom i les seccions es munten sobre diapositives metàl·liques (coure).
Tècnica de gravat per congelació: aquest és un mètode alternatiu per visualitzar orgànuls dins de les cèl·lules per a la preparació de mostres.
Les cèl·lules es congelen ràpidament, després s'escalfen → es trenquen amb un ganivet per exposar els orgànuls interns → es sublimen → es cobreixen amb recobriments de platí i carboni.
Les mesures per millorar el contrast EM inclouen:
Tinció amb solucions de sals de metalls pesants com el citrat de plom i l'acetat d'uranil
Tinció negativa amb metalls pesants com l'àcid fosfotúngstic o l'acetat d'uranil.
Ombreig: l'exemplar està recobert amb una fina pel·lícula de platí o un altre metall pesat en un angle de 45 graus de manera que el metall colpeja els microorganismes només per un costat.
